清腦宣竅方中藥有效成分和作用機(jī)理研究論文
1、器材
Waters 2695高效液相色譜儀，2696PDA檢測器，自動(dòng)進(jìn)樣；1100LC-MSD-Trap-XCT/Plus型液質(zhì)聯(lián)用儀 （美國Agilent公司）；Sartorious BT 25S型1/100000電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；QL-901漩渦混和機(jī)（其林貝爾儀器制造公司）；臺(tái)式高速離心機(jī)（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠），勻漿機(jī)。
梔子苷，人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1及三七皂苷R1對照品均購自中國藥品生物制品檢定所（批號(hào)分別為：110749-200309，110703-200322，110745-200312，110704-200318）；人參皂苷Re，Galioside，6α－Hydroxygeniposide，3,3',5,5'-四甲氧基-4,4'-二-β-D-葡萄糖雙環(huán)氧木脂素，6″－對香豆酰龍膽京尼平雙糖苷，藏紅花酸-1-葡萄糖（6-1）葡萄糖苷，京尼平龍膽雙糖苷，2α，3β，19α，23-四羥基齊墩果-12-烯-28-酸，人參皂苷Rb2，Rb3，Rh1、Rf，Rc，Rg2，Rg3，Rd及三七皂苷fa，R4，R7及 F2對照品由北京中醫(yī)藥大學(xué)石任兵教授課題組提供。
乙腈（Fisher公司），色譜純；屈臣氏重蒸水（液相用水）；Milli-Q系統(tǒng)純化水（液質(zhì)用水）；肝素、水合氯醛及甲酸為分析純，均購自北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司。Cleanert C18 SPE固相萃取柱（3 ml，200 mg，60 μm，北京艾杰爾科技有限公司）實(shí)驗(yàn)對象：SD大鼠：體重（300±10）g，雄鼠［北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證編號(hào)：SCXK（京）2007－0001］。
2、方法
2.1 給藥劑量及腦組織處理方法單劑量灌服清腦宣竅有效部位（6.0 g/kg）；灌服清腦宣竅有效部位后1 h取出大腦，吸干水分，精密稱重，加入腦重量兩倍體積的生理鹽水。以18 000 r/min勻漿，勻漿液加入兩倍體積的分析甲醇，渦旋振蕩10 min,混合液在6 000 r/min下離心20 min,取出上清液。殘?jiān)偌尤雰杀扼w積甲醇渦旋振蕩10 min, 6 000 r/min下離心20 min,兩次上清液混合，常溫減壓回收至干。殘?jiān)? ml液相水溶解，超聲振蕩，上SPE固相萃取柱，先用水洗脫3 ml，再用甲醇洗脫2 ml，收集甲醇洗脫液，常溫減壓干燥，殘?jiān)蛹状?00 μl 漩渦溶解，即得供試品溶液。
2.2 HPLC-MS條件色譜柱：
Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；保護(hù)柱：Eclipse XDB-C18；柱溫：30℃；流速：1.0 ml /min；檢測波長：203，238nm；乙腈（A）-酸水（B）二元梯度洗脫，梯度為：5%A17 min →16%A23 min →16%A28 min →20%A34 min →22%A50 min →30%A65 min →45%A80 min →100%A。1100LC-MSD-Trap-XCT/Plus型液質(zhì)聯(lián)用儀：質(zhì)譜（MS）條件：ESI離子源；離子源溫度350℃；毛細(xì)管電壓：3 000 eV；負(fù)離子檢出模式；霧化氣壓力：60 psi；干燥氣：N2；流速：12 L/min；掃描范圍：200～1 800 m/z。
傳統(tǒng)中藥研究與現(xiàn)代分析技術(shù)手段結(jié)合，是中藥現(xiàn)代化的必須［7］。一個(gè)療效確切的復(fù)方進(jìn)入人體內(nèi)的成分譜中多數(shù)成分是否存在對疾病的`多靶點(diǎn)基因表達(dá)的調(diào)控作用，必須建立在確認(rèn)該成分（代謝產(chǎn)物）在靶器官內(nèi)是否存在的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行體內(nèi)外藥效學(xué)研究。
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